El acrosoma es una organela membranosa de doble capa ubicada en la parte apical de la cabeza espermática, que contiene distintas enzimas hidrolíticas, como la hialuronidasa y la acrosina. Estas enzimas de la zona pelucida desempeñan un papel fundamental en la reacción acrosomal, un proceso exocitótico crucial para la fecundación.
La determinación de la integridad acrosomal es un parámetro espermático de importancia debido a su papel en la reacción acrosomal (RA). La RA es un proceso exocitótico que consiste en la fusión del acrosoma con la membrana plasmática, resultando en la exposición y liberación del contenido acrosomal al medio extracelular (Ramalho-Santos et al., 2002), permitiendo que se realice la fecundación del ovocito.
La liberación del contenido acrosomal se lleva a cabo cuando el espermatozoide entra en contacto con mecanismos de señalización que se encuentran en la zona pelúcida (Harrison, 1998) y está mediado por la progesterona (Patrat et al., 2000), además de estar regulado por el incremento intracelular de calcio.
Existen distintos inductores in vitro que se utilizan para la reacción acrosomal (Patrat et al., 2000) siendo el más conocido el Calcio ionóforo A23187 (Carretero et al., 2015). Este trabaja mediante el flujo de iones de Ca+2 y K+, que es clave en el diálogo molecular que se establece entre el espermatozoide, su medio ambiente y el ovocito, tanto en los procesos de maduración como de capacitación espermática para la reacción acrosomal (Cardona et al., 2006).
Técnicas para la evaluación de la integridad acrosomal
Existen diversas técnicas para la evaluación de la integridad acrosomal, entre ellas la microscopía de campo claro, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.
- Microscopía de campo claro : Esta técnica utiliza tinciones como el azul tripán y giemsa para determinar la integridad acrosomal y la viabilidad espermática. Se ha utilizado en alpacas (Banda et al., 2010; Santiani et al., 2005) y llamas (Fumuso et al., 2015).
- Microscopía de fluorescencia : Se utilizan fluorocromos como el isoticianato de fluoresceína (FITC) conjugado con lectinas, que tienen afinidad por el acrosoma. FITC-PNA se une a los terminales β-galactosa que se encuentran dentro de la membrana acrosomal externa (Silva et al., 2006; Hernández et al., 2012), mientras que FITC-PSA se une a glucoproteínas que se encuentran en la matriz acrosomal (Silva et al., 2006; Celeghini et al., 2010). Al haber daño en la membrana acrosomal, las lectinas pueden unirse a su zona de anclaje, reflejándose como fluorescencia de color verde. Estas lectinas han sido empleadas para la evaluación acrosomal en espermatozoides de humano (Risopatron et al., 2001), porcino (Siciliano et al., 2008), ovino (Celeghini et al., 2010) y conejo (Hernández et al., 2012).
- Citometría de flujo : Esta técnica permite una evaluación más segura, objetiva y rápida de un flujo celular mediante la detección de intensidades de fluorescencia (Gillan et al., 2005). Se ha utilizado en alpacas (Cheuquemán et al., 2013) y llamas (Carretero et al., 2015) para evaluar la viabilidad e integridad acrosomal.
Las técnicas de microscopía de campo claro y de fluorescencia son de baja precisión y laboriosas, mientras que la citometría de flujo ofrece una evaluación más precisa y rápida.
El presente estudio
Este estudio se centró en determinar el porcentaje de integridad acrosomal en espermatozoides epididimarios de alpaca utilizando Arachis hypogaea (PNA) y Pisum sativum (PSA), conjugadas con FITC y evaluadas mediante citometría de flujo con sistema analizador de imágenes.
Materiales y métodos
Se obtuvieron 45 testículos de alpaca del camal municipal del distrito de Ninacaca, en la provincia de Pasco, Perú. Los testículos fueron lavados con suero fisiológico a 5 °C y se les retiró la túnica vaginal. Se colocaron en frascos con suero fisiológico a 5 °C y se llevaron a Lima (20 horas aproximadamente) en cajas transportadoras con refrigerantes a 5 °C, según lo descrito por Banda et al. (2010).
En el laboratorio, los testículos fueron lavados con PBS a 38 °C, se separaron las colas del epidídimo con tijera y se colocaron en placas petri. En las placas se colocó 1 ml de medio TRIS (Tris 71 g, ácido cítrico 4 g y fructuosa 1 g csp 100 ml) y con la ayuda de una pinza y una hoja de bisturí se les realizaron pequeños cortes y se prensaron suavemente con el fin de liberar los espermatozoides. Se recuperó 1 ml de cada muestra y se evaluó la motilidad (%) y concentración espermática (espermatozoides/ml). Al final, solo se trabajaron 29 muestras con motilidad mayor de 30% y con una concentración mayor de 50x106 espermatozoides/ml.
Se evaluó la viabilidad e integridad acrosomal mediante los siguientes procedimientos:
- FITC-PNA/PI: se tomó 100 µl de cada muestra y se incubó por 8 minutos a 38 °C con 0.5 µl de solución Stock de FITC PNA (100 µg/ml) para obtener una concentración de 0.5 µg/ml. Se adicionó 0.5 µl de solución Stock de PI (1 mg/ml) para llegar a una concentración final de 5 µg/ml.
- FITC-PSA/PI: se tomó 100 µl de cada muestra y se incubó por 8 minutos a 38 °C con 5 µl de solución Stock de FITCPSA (100 µg/ml) para obtener una concentración de 5 µg/ml de FITC-PSA. Se adicionó 0.5 µl de solución Stock de PI (1 mg/ml) para llegar a una concentración final de 5 µg/ml.
Se utilizó el citómetro de flujo FlowSight (Amnis, Seattle, EEUU), equipado con un sistema analizador de imágenes. El software de adquisición usado fue INSPIRE® v. 100.210 (Amnis, Seattle, EEUU) y el software para analizar los datos fue IDEAS® v. 2 (Amnis, Seattle, EEUU). Se adquirieron 10 mil eventos compatibles con espermatozoides según su tamaño y proporción largo/ancho. Los eventos fueron excitados con un láser de longitud de onda de 488 nm y potencia de 20 mW. La evaluación de la intensidad de fluorescencia de FITC-PNA y FITC-PSA se realizó utilizando un canal de detección de 505 a 560 nm (Ch02), mientras que la intensidad de fluorescencia de PI se realizó utilizando un canal de detección de 642 a 740 nm (Ch05).
Resultados
Se determinó que entre 93 y 95% de espermatozoides presentaron el acrosoma íntegro cuando fueron evaluados utilizando FITC-PNA y FITC-PSA, respectivamente. Estos resultados indicarían que un elevado porcentaje de espermatozoides epididimarios de alpaca tiene la capacidad de atravesar la zona pelúcida del ovocito durante la fecundación.
Con respecto a la viabilidad espermática, se encontró 60% de espermatozoides vivos cuando se utilizó la combinación FITCPNA/ PI y 63% al evaluarlos con FITC-PSA/ PI. El menor porcentaje de espermatozoides viables podría estar relacionado al tiempo transcurrido entre el beneficio de las alpacas con su evaluación en el laboratorio, así como a la técnica de recuperación de espermatozoides.
En relación con la viabilidad e integridad acrosomal, se encontró 59 y 61% de espermatozoides vivos con acrosoma intacto utilizando FITC-PNA/PI y FITC-PSA/PI, respectivamente. Se podría deducir que el menor porcentaje de espermatozoides viables con acrosoma intacto se debe principalmente al reducido porcentaje de espermatozoides viables y no al incremento del daño acrosomal.
Discusión
Este estudio confirma la utilidad de la citometría de flujo para evaluar la integridad acrosomal en espermatozoides epididimarios de alpaca. Los resultados obtenidos utilizando FITC-PNA y FITC-PSA son consistentes con estudios previos que empleaban otras técnicas, lo que sugiere que estas lectinas son herramientas fiables para evaluar la integridad acrosomal en alpacas.
El estudio también destaca la importancia de considerar la viabilidad espermática al evaluar la integridad acrosomal. El menor porcentaje de espermatozoides viables en este estudio, en comparación con estudios previos, podría deberse a factores como el tiempo transcurrido entre la obtención de las muestras y su evaluación, así como a la técnica de recuperación de espermatozoides.
Es posible evaluar la integridad acrosomal en espermatozoides epididimarios de alpaca usando las lectinas Arachys hypogaea (PNA) y Pisum sativum (PSA) conjugadas con isoticianato de fluoresceína (FITC) mediante un citómetro de flujo con analizador de imágenes.
Este estudio proporciona información valiosa para la investigación en reproducción animal, particularmente en la evaluación de la calidad espermática en alpacas. La citometría de flujo con sistema analizador de imágenes se presenta como una herramienta prometedora para la evaluación de la integridad acrosomal y la viabilidad espermática, lo que podría contribuir a mejorar las estrategias de reproducción en esta especie.
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